Ketika salah seorang ilmuwan bernama Leonardo Vetra yang bekerja di CERN terbunuh, di dadanya terlihat sebuah tanda yang mengarah pada sebuah persaudaraan yang diduga telah musnah. Kematian yang tak wajar ini membuat para ilmuwan di CERN terpaksa harus menghubungi pakar simbol Robert Langdon (Tom Hanks).

Langdon yang semula tak percaya bahwa persaudaraan Illuminati ini masih ada mau tak mau harus menerima kenyataan karena tak ada orang yang sanggup membuat tanda ambigram sempurna yang menjadi simbol Illuminati kecuali dari persaudaraan rahasia ini sendiri.

Akhirnya Langdon dan Vittoria Vetra (Ayelet Zurer) pergi ke Vatican di mana persaudaraan Illuminati mengancam akan meledakkan kota suci ini dan membunuh semua orang di dalamnya. Satu-satunya cara melacak si pembunuh adalah dengan mengikuti tanda-tanda yang ditinggalkan anggota Illuminati dengan harapan dapat mencegah pembunuhan massal ini.